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纤维素酶活力的测定

文章来源:夏盛集团发布时间:2016-12-23浏览量:


 酶活单位定义 

0 37℃和 pH 5.5 的条件下,每分钟从浓度为 4 mg/ml 的羧甲基纤维素钠溶 液中分解释放 1μmol 的还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量为一个酶活单位。 

夏盛集团可生产食品级和饲料级纤维素酶
夏盛集团可生产食品级和饲料级纤维素酶

测定原理 

纤维素酶能将羧甲基纤维素钠降解成寡糖和单糖。具有还原性的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与 DNS 试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此,通过比色法测定反应液颜色强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力。

3 试剂与溶液

除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合 GB/T 6682 中规定的

二级水。

3.1 氢氧化钠溶液,浓度c(NaOH)为200 g/L 

称取氢氧化钠 20.0 g。加水溶解,定容至 100 ml。 

3.2 乙酸溶液,浓度c(CH3COOH)为0.1 mol/L 

吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解,定容至100 ml。 

3.3 乙酸钠溶液,浓度c(CH3COONa)为0.1 mol/L 

称取三水乙酸钠 1.36 g。加水溶解,定容至 100 ml。 

3.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液,浓度为0.1 mol/L,pH值为5.5 

称取三水乙酸钠23.14 g,加入冰乙酸1.70 ml,再加水溶解,定容至2000 ml。测定溶液pH值。如果溶液pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5。

3.5 羧甲基纤维素钠溶液,浓度为8g/L

称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.40 g,加入40 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解 (注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过50 ml ) 。然后停止加热,继续搅拌30 min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液定容至50 ml。羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀。4℃避光保存,有效期为3d。

3.6 葡萄糖溶液,浓度10 mg/ml

准确称取1.000g无水葡萄糖(105℃烘至恒重),加乙酸-乙酸钠缓冲溶液

(3.4)溶解,定容至100 ml。

3.7 DNS 试剂 

称取 3,5-二硝基水杨酸 3.15 g(化学纯),加水 500 ml,搅拌 5s,水浴至 45℃然后逐步加入 100 ml 氢氧化钠溶液(3.1),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过 48℃ )。再逐步加入四水酒石酸钾钠 91.0 g、苯酚 2.50 g 和无水亚硫酸钠 2.50 g。继续 45℃水浴加热,同时补加水 300 ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至 1000 ml。用玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存。

室温下存放 7d 后可以使用,有效期为 6 个月。

 

4 仪器与设备

4.1 实验室用样品粉碎机或研钵 

4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目) 

4.3 分析天平:感量0.001g 

4.4 pH计:精确至0.01 

4.5 磁力搅拌器:附加热功能 

4.6 电磁振荡器 

4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45μm 

4.8 离心机:2000g以上 

4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30-60℃之间,精度为0.1℃ 

4.10 秒表:每小时误差不超过5s 

4.11 可见分光光度计 

4.12 移液器:精度为 1μl 

5 标准曲线

 

标准空白样:吸取4 .0ml缓冲液,加入5.0 ml DNS,振荡,沸水浴加热5 min。然后在自来水中冷却,再用蒸馏水定容至25.0 ml。

葡萄糖标准溶液:分别吸取标准葡萄糖溶液(3.6)1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL,分别用缓冲溶液(3.4)定容至100 ml,配制成浓度为0.1-0.7 mg/ml葡萄糖标准溶液。

吸取上述不同浓度的葡萄糖标准液各2.0 ml(做2个平行)到刻度试管中,加入2.0 ml缓冲液(3.4),震荡,加入5.0ml DNS试剂,震荡。沸水浴加热5 min 。然后在自来水中冷却。再用蒸馏水定容至25.0 ml,震荡摇匀。以标准空白样作为基准,调零。在540 nm处测定吸光度。

以葡萄糖标准溶液浓度为 Y 轴、吸光度 OD 值为 X 轴,绘制标准曲线。每次新配制 DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。

6 待测酶液制备

 

6.1 固体样品的反应用酶液的制备

固体样品应粉碎或充分碾碎,然后过 60 目筛(孔径为 0.25mm),按照附录 A 建议的称样量称取试样两份,精确至 0.001g,加入 50ml 乙酸-乙酸钠缓冲溶液(3.4),磁力搅拌 30min,再用缓冲溶液(3.4)定容至 100ml,在 4℃条件下避光保存 24h。摇匀,取出 30-50ml,离心 3min,吸取上清液,再用缓冲溶液(3.4)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶的活力最好能控制在 0.04

-0.08U/ml 之间)。

6.2 液体样品的反应用酶液的制备

液体试样可直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(3.4)进行稀释、定容(稀释后的待测酶液中纤维素酶的活力最好能控制在0.04-0.08U/ml之间)

如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5,然后再用缓冲溶液(3.4)做适当稀释定容。

7 测定步骤

 

7.1 平衡预热

吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.5),37℃平衡10 min。

吸取 10.0ml 经过适当稀释的酶液(6.1 或者 6.2),37℃平衡 10 min。

7.2 酶空白样

吸取2.0 ml酶的稀释液,加入5.0ml DNS试剂,震荡3s,加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液,在37℃精确保温30 min,沸水浴加热 5 min 。用自来水冷却至室温,加水定容至25.0ml,振荡3 s。以标准空白样(参见5)为空白对照,在540nm处测定吸光度AB。

7.3 待测酶样

吸取2.0 ml待测酶稀释液(已经过37℃平衡)到试管中,加入2.0 ml羧甲基纤维素钠溶液(已经过37℃平衡),震荡,在37℃精确水浴30 min。加入5.0 mlDNS试剂,振荡,以终止酶解反应。在沸水中加热5 min,用自来水冷却至室温,加水定容至25.0 ml,振荡3 s。以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE。

7 酶活力计算

 

D  =

[( AE

- AB ) ´ K + C0

]

´1000

式 1

 

 

 

´ t

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

式(1)中:

XD——稀释酶液中纤维素酶的活力,U/ml;

AE——酶反应液的吸光度;

AB——酶空白样的吸光度;

K——标准曲线的斜率;

C0——标准曲线的截距;

M——葡萄糖的摩尔质量,180.2g/mol;

t  ——酶解反应时间,min;

1000——单位转换,1mmol = 1000μmol

XD值应在0.04-0.08 U/ml之间。如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定。

 

= X D ´ D f 公式 2

 

式(2)中:

X——试样纤维素酶的活力,U/g(或 U/ml)

Df——试样的总稀释倍数。

酶活力的计算值保留三位有效数字。

8 重复性

同一试样两个平行测定值的相对误差不超过 8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)。

附录A 试样酶活力与建议称样量的关系

 

纤维素酶活力u/g

称样量g

 

 

 

 

≥2000

0.10.2

 

 

 

 

 

 

5002000

0.20.5

 

 

 

 

200500

0.51.0

 

 

 

 

50200

1.02.0

 

 

 

 

1050

2.05.0

 

 

 

 

110

5.010.0

 

 

 

 

 

 

 

 

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