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饲料添加剂木聚糖酶活力的测定

文章来源:夏盛集团发布时间:2017-02-22浏览量:


分光光度法

1 酶活单位定义 

0 37℃和 pH 5.5 的条件下,每分钟从浓度为 5 mg/ml 的木聚糖溶液中降解 释放 1 μmol 的还原糖(以木糖计)所需要的酶量为一个酶活单位 U。 

2 原理 

木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色法测定反应液颜色强度,可以计算反应液中木聚糖酶的活力。

3 试剂与溶液

除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合 GB/T 6682 中规定的二级水。

3.1 氢氧化钠溶液,浓度 c(NaOH)为 200 g/L 

称取氢氧化钠 20.0 g,加水溶解,定容至 100 ml。 

3.2 乙酸溶液,浓度 c(CH3COOH)为 0.1 mol/L 

吸取冰乙酸 0.60 ml,加水溶解,定容至 100 ml。 

3.3 乙酸钠溶液,浓度 c(CH3COONa)为 0.1 mol/L 

称取三水乙酸钠 1.36 g。加水溶解,定容至 100 ml。 

3.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液,浓度为 0.1 mol/L,pH 值为 5.5

称取三水乙酸钠23.14 g,加入冰乙酸1.70 ml,再加水溶解,定容至2000 ml测定溶液pH值。如果溶液pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5。

3.5 木糖溶液,浓度为 10 mg/ml

准确称取 1.000g 无水木糖,加乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.4)溶解,定容至100 ml。

3.6 木聚糖溶液,浓度为 10 mg/ml

称取木聚糖(Sigma 公司所产桦木木聚糖,产品编号:x0502)1.00 g,加入氢氧化钠 0.32 g,再加 90ml 水,磁力搅拌,同时缓慢加热,直至木聚糖完全溶解。然后停止加热,继续搅拌 30 min,加入冰乙酸 0.5 ml。继续磁力搅拌,测定其 pH 值。如果溶液 pH 值偏离 5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至 5.5。然后再用乙酸-乙酸钠缓冲液定容到 100 ml。使用前适当摇匀,4℃避光保存,有效期为 12 h。

3.7 DNS 试剂

称取 3,5-二硝基水杨酸 3.15 g(化学纯),加水 500 ml,搅拌 3~5s,水浴至45℃。然后逐步加入 100 ml 氢氧化钠溶液(3.1),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过 48℃ )。再逐步加入四水酒石酸钾钠 91.0 g、苯酚 2.50 g 和无水亚硫酸钠 2.50 g。续 45℃水浴加热,同时补加水 300 ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至 1000 ml。用玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色瓶中,

避光保存。室温下存放 7d 后可以使用,有效期为 180 d

4 仪器与设备

4.1 实验室用样品粉碎机或研钵

4.2 分样筛:孔径为0.25 mm(60目) 

4.3 分析天平:感量0.001g 

4.4 pH计:精确至0.01 

4.5 磁力搅拌器:附加热功能 

4.6 电磁振荡器 

4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45μm 

4.8 离心机:最大离心速度不小于2000 g 

4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30-60℃之间,精度为0.1℃ 

4.10 秒表:每小时误差不超过5s 

4.11 可见分光光度计 

4.12 移液器:精度为1μL 

5 标准曲线

标准空白样:吸取4.0ml乙酸-乙酸钠缓冲液(3.4),加入5.0ml DNS,振荡 混匀。沸水浴5 min。用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样。

木糖标准溶液:分别吸取标准木糖溶液(3.5)1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml、和7.00 ml,分别用缓冲溶液(3.4)定容100 ml,配制成浓度为0.1-0.7 mg/ml木糖标准溶液。分别吸取上述标准液2.0 ml到刻度试管中(做两个平行),再分别加入2.0 ml缓冲液(3.4)和5.0ml DNS试剂,电磁震荡3s~5s。沸水浴精确加热5 min 。然后在自来水中冷却至室温。再用蒸馏水定容至25.0,震荡摇匀。以标准空白样调零,在540 nm处测定吸光度A值。测定值做2个重复,取平均值。

以木糖标准溶液浓度为Y轴、吸光度A值为X轴,绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。

6 反应用酶液的制备

6.1 固体样品的反应用酶液的制备

按照附录A建议的称样量称取试样两份,精确至0.001g,加入40 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(3.4),磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.4)定容至100 ml,在4℃条件下避光保存1-2 h。上离心机1000 g离心3~5 min,吸取上清液,再用缓冲溶液(3.4)做二次稀释(稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04~0.10 U/ml之间

6.2 液体样品的反应用酶液的制备

液体样品可直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(3.4)进行稀释、定容(稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04~0.10 U/ml之间)如果稀释后酶液pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5,然后再用缓冲溶液(3.4)做适当稀释定容。

7 测定步骤

7.1 平衡预热

吸取10.0ml木聚糖溶液(3.6),37℃平衡20 min。

吸取 10.0ml 经过适当稀释的酶液(6.1 或者 6.2),37℃平衡 10 min。

7.2 酶空白样

吸取 2.0 ml 经平衡的酶稀释液加入到刻度试管中,加入 5.0ml DNS 试剂,震荡 3-5s,然后加入 2.0 ml 木聚糖溶液(3.6),在 37℃精确保温 30 min,沸水浴加热 5 min 。用自来水冷却至室温,加水定容至 25.0ml,振荡 3~5s。以标

准空白样(参见 5)为空白对照,在 540 nm 处测定吸光度 AB。 

7.3 待测酶样

吸取2.0 ml待测酶稀释液(已经过37℃平衡)到刻度试管中,加入2.0 ml木聚糖溶液(已经过37℃平衡),震荡,在37℃精确水浴30 min。加入5.0ml DNS试剂,振荡,以终止酶解反应。在沸水中加热5 min,用自来水冷却至室温,加水定容至25.0 ml,振荡3~5 s。以标准空白样为空白对照,在540 nm处测定吸光度AE。

8 试样酶活力的计算

 

XD值应在0.04~0.10 U/ml之间。如果不在这个范围内,应重新选择酶液的

稀释度,再进行分析测定。

式(2)中:

X——试样木聚糖酶的活力,U/g(或 U/ml);

Df——试样的总稀释倍数。

酶活力的计算值保留三位有效数字

8 重复性

同一试样两个平行测定值的相对误差不超过 8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)。

附录A试样酶活力与建议称样量的关系

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