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果胶裂解酶活力测定方法

文章来源:夏盛集团发布时间:2017-02-22浏览量:


果胶酶酶活检测方法
果胶酶酶活检测方法

果胶酶已经广泛应用于各种果汁生产的工艺流程中,诺维信的各种酶制剂一直在行业内遥遥领先,使国内酶制剂厂家都望尘莫及,而在去年夏盛集团终于生产出了可以与诺维信叫板的果汁专用果胶酶产品。本文介绍了果胶酶的酶活检测方法。
1 定义

在测定条件下,每分钟作用果胶产生1µmol双键所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。

 原理

果胶酶作用果胶产生不饱合寡聚半乳糖醛酸。反应产物分子中C-4和C-5之间有一与C-5上羧基相连的双键,使之在235nm波长有最大吸收。分子消光系数为5500cm2 /mmol

3  试剂

3.1  琥珀酸钠(C4H4O4Na2·6H2O)       3.3  浓盐酸(HCL)

3.2  琥珀酸(C4H6O4)                 3.4  果胶(Sigma公司,P9135)

  本标准中所用的试剂,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。

4 仪器和设备

4.1  实验室常用仪器设备。                       4.6  秒表(数字显示)

4.2  恒温水浴:(30±0.5℃)。                    4.7  分析天平(0.0001g)

4.3  分光光度计(波长范围200-1000nm)          4.8  磁力搅拌器。

4.4  移液管                                     4.9  离心机:转速为30000r/min以上。

4.5  酸度计:精确至小数点后2位。

5 溶液

5.1  0.05mol/L,pH=5.2琥珀酸缓冲液

称取琥珀酸钠(C4H4O4Na2)13.51g于900ml水中,溶解后用琥珀酸(C4H6O4)调pH值至5.2,定容至1000ml,校正pH值后置冰箱中备用。

5.2  2mol/L盐酸

准确量取16.7ml浓盐酸,用水定容至100ml。

5.3  0.425%果胶溶液(底物)

称取0.425g果胶于80ml缓冲液中,至少搅拌3h,溶解后于4放置16h,用缓冲液定容至100ml, 4保存。 用时30000rpm/min离心30min ,取上清液用于测定。

6  分析步骤:

6.1待测酶液的制备

6.1.1  根据酶活力确定稀释倍数,使酶浓度控制在大约 0.06-0.09u/mL,即光吸收值在0.250.40范围内。

6.1.2  称取酶粉1g,精确至0.0001g,(或吸取酶液1.00 ml)。用蒸馏水溶解,置于磁力搅拌器上搅拌10分钟,全部移入容量瓶中,稀释倍数小于500倍的直接用缓冲液(5.2)溶解。4000rpm/min离心5分钟,上清液液根据稀释倍数再进行稀释,最后一次用缓冲液稀释,供测试用。

6.1.3  酶液在4小时以后必须重新称量,稀释。

6.2 测定:

按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(5.3)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致, 30℃水解30min.

反应步骤及试剂、溶液用量见下表:

顺序

试样

空白

1

加底物(5.3) 2.9mL

加底物(5.3) 2.9mL

2

30℃预热3分钟

30℃预热3分钟

3

加酶液0.1 mL

30℃水解30 min

4

混合

盐酸(5.2)1 mL

5

30℃水解30min

混合

6

盐酸(5.2)1mL

加酶液0.1 mL

7

混合

混合

8

空白调零后,235nm下测定

235nm调零

 

7  计算:

则,X

A×1000×4×F

u/ml(g)

30×0.1×5500

   式中:  A-光吸收值;

1000-mmol与µmol之间的换算关系;

4-反应总体积(ml);

F-酶样品稀释倍数;

30-反应时间(min);

0.1-测定所取酶溶液量(ml);

5500-分子消光系数。

8  结果的允许差:

平行试验相对误差不得超过5%

 

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